Ученые из Медицинского института Говарда Хьюза усовершенствовали метод флюоресцентной микроскопии таким образом, что теперь с ее помощью можно снимать в высоком разрешении динамические процессы, происходящие в живом организме. О результатах своей работы ученые поделились в научном журнале Science, а пример визуализации динамических процессов, в качестве которого выступила съемка передвижения иммунных клеток в эмбрионе рыбки, был представлен в статье журнала Nature.
Благодаря нынешним возможностям световой микроскопии, в частности флюоресцентной микроскопии высокого разрешения, ученые могут рассматривать даже трехмерные фрагменты живых тканей. Ранние работы по преодолению дифракционного предела разрешения светового микроскопа и разработка методов неинвазивной флюоресцентной визуализации принадлежат Эрику Бетцигу, Штефану Хеллу и Уильяму Мернеру. За это ученые даже были удостоены Нобелевской премии по химии в 2014 году.
Исследователи решили на этом не останавливаться. Так? одной из последних разработок Бетцига стала флюоресцентная микроскопия плоскостного освещения (light sheet fluorescence microscopy), позволяющая визуализировать объемные живые биологические образцы в течение длительного времени. А ее модификация, микроскопия светового листа с дискретным освещением (lattice light sheet microscopy — LLSM), позволяет визуализировать быстрые динамические процессы. В основе двух методов лежит быстрое сканирование образца тонким плоским пучком света, позволяющее накапливать большое количество двумерных изображений, которые затем объединяют в трехмерную модель.
У этих методов, тем не менее, есть свои ограничения. Например, неоднородность окружающих тканей вносит искажения при определении сигнала, что уменьшает разрешение картинки. Даже в отсутствие искажений высокое разрешение требует высокой интенсивности облучения, в результате чего живой образец может получить повреждения. Получение самых качественных изображений все равно требовало фиксации и специальной подготовки образцов.
Команда Бетцига смогла обойти эти ограничения и представила комбинированную технику микроскопии, при помощи которой ученые смогли пронаблюдать за множеством разных процессов прямо внутри живого организма. Исследователи получили изображение движения клатриновых пузырьков, динамику клеточных органелл, рост отростков нервных клеток в формирующемся спинном мозге и перемещение иммунных клеток в эмбрионе модельной рыбки данио-рерио. На видео ниже, например, показана миграция иммунных клеток в перилимфатическое пространство внутреннего уха эмбриона.
Для модернизации метода LLSM ученые использовали методы адаптивной оптики, применяемые в создании наземных телескопов, использующихся для астрономии. Команда Бетцига измеряла величину искажений при определении специальной флюоресцентной метки и корректировала их с помощью изменяемой формы адаптивного зеркала. Комбинированная техника получила название AO-LLSM. Уменьшить фототоксичность пучка удалось при помощи ограничения освещения только тонкой плоскостью образца без облучения его основного объема.
Ученые надеются, что их разработка поможет существенно продвинуться в исследовании клеток в их естественной среде. Сейчас команда думает над тем, как уменьшить стоимость подобного микроскопа, а также над тем, как сделать его более компактным. В настоящий момент установка микроскопа занимает трехметровый стол.
